1-1-اهمیت و ضرورت انجام تحقیق

 

روغن یکی از ضروری­ترین مواد غذایی برای تغذیه انسان بوده که کمیت و کیفیت آن تاثیر چشمگیری بر سلامت انسان دارد (ناصری, 1375). دانه­های روغنی دومین منبع غذایی مردم جهان را تشکیل می­دهند (باراک[1]، 2006). این محصولات علاوه بر دارا بودن ذخایر اسیدهای­چرب حاوی پروتئین نیز می­باشند. استفاده از پروتئین­های گیاهی به جای گوشت و نیز معرفی دانه­های روغنی جدید مانند سویا و کلزا به بازار­های جهانی سبب اهمیت روز افزون این محصولات شده است. همگام با رشد جمعیت و بهبود سطح زندگی به خصوص در کشور­های در حال توسعه، تقاضا برای روغن­ها و نیز پروتئین­های گیاهی که از محصولات فرعی دانه­های روغنی می­باشد، افزایش یافته است و از این رو یکی از مهم­ترین مسائل مورد بحث در کشاورزی و صنعت کشور­ها به شمار می­رود (کاکای[2] و همکاران، 2009). همچنین افزایش مصرف کنجاله دانه­های روغنی در تغذیه دام و طیور نیز نیاز به تولید دانه­های روغنی را در جهان افزایش داده است (سیداحمدی و کریمی, 1382). اهمیت روغن­های نباتی نیز به دلیل افزایش جمعیت و بالا رفتن میزان مصرف، روز به روز بیشتر می­شود. از این رو لزوم برنامه­ریزی بلند مدت و منسجم با هدف نیل به خود کفایی در تولید روغن خوراکی غیر قابل انکار خواهد بود (شیرانیان و دهشیری[3]، 2003 ).

 

مصرف روغن در ایران طی سالهای اخیر به دلیل رشد جمعیت و مصرف سرانه، افزایش یافته است، به طوری که با در نظر گرفتن مصرف سرانه 14 کیلو­گرم، سالانه حدود 750 هزار تن روغن مورد نیاز می­باشد. این در حالی است که کمتر از 10% از این روغن، در داخل کشور تولید می­گردد (سپهر و همکاران، 1382)

 

در حال حاضر بیش از 85% روغن خوراکی مورد نیاز کشور از خارج وارد می­شود که این به نوبه خود سبب وابستگی شدید به واردات روغن و در نتیجه خروج ارز از کشور می­شود با توجه به اهمیت روغن در جیره غذایی انسان، ضرورت کشت دانه­های روغنی و نزدیک شدن به خود کفایی در زمینه تولید روغن مورد نیاز کشور بسیار پراهمیت می­باشد (عطایی­کچویی و همکاران، 1388).

 

آفتابگردان یکی از مهم­ترین گیاهان روغنی به شمار می­آید که بعد از پنبه و سویا بیش­ترین سهم تولید داخلی را به خود اختصاص داده است (خطیبی و همکاران، 1392) روغن آن به دلیل داشتن اسیدهای چرب غیراشباع فراوان و همچنین فقدان كلسترول از كیفیت بالایی برخوردار است (نظامی و همکاران، 2008). و سطح زیر کشت آن در سال­های اخیر در کشور کاهش یافته است (صفاری، 1381) و درحال حاضر بیش از80000 هکتار می­باشد (رحیمی و همکاران، 1382). این محصول با داشتن حدود 40-50% روغن با کیفیت مطلوب، می­تواند به عنوان یک گیاه زراعی مطمئن در دامنه وسیعی از شرایط محیطی، عملکرد قابل توجهی داشته باشد (کریم­زاده­اصل، 1382)

 

آفتابگردان عمدتا به عنوان یک منبع تامین کننده روغن در جهان مطرح است. و عملکرد آن در خاک­های نسبتا فقیر رضایت­بخش بوده و به همین دلیل در محدوده وسیعی از زمین­های کشاورزی کشت می­شود. به گرما و سرما مقاوم است در مواردی که درجه حرارت از 10 درجه سانتی­گراد کمتر نشود، رشد نمو آن رضایت­بخش خواهد بود این درجه حرارت کمتر را بدون صدمه می­تواند تحمل کند این سازگاری مطلوب باعث گردیده که کشت آن در شرایط اقلیمی متفاوت امکان­پذیر گردد (کوچکی و همکاران، 1367).

 

1-2-پرسش تحقیق

 

آیا امکان بررسی تنوع ژنتیکی توده­های بومی آفتابگردان استان خراسان شمالی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR وجود دارد؟

 

آیا در بین توده­های مورد بررسی تنوع ژنتیکی وجود دارد؟

 

1-3-اهداف تحقیق

 

ارزیابی امکان استفاده از نشانگر مولکولی ISSR در بررسی تنوع ژنتیکی آفتابگردان

 

بررسی تنوع ژنتیکی توده[4]­های آفتابگردان مورد بررسی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR

 

تعیین میزان فاصله ژنتیکی بین توده­های مورد بررسی و استفاده از اطلاعات به دست آمده در مراکز تحقیقاتی

 

1-4-فرضیه­ها

 

تنوع ژنتیکی بین توده­های بومی آفتابگردان استان خراسان شمالی وجود دارد.

 

برای تشخیص تنوع ژنتیکی آفتابگردان، می­توان از نشانگرهای مولکولی استفاده کرد.

 

روش ISSR روش مناسبی برای بررسی تنوع ژنتیکی است.

 

1-5-هنر و دانش اصلاح نباتات

 

هنر اصلاح نبات به مهارت اصلاح کننده در مشاهده و تشخیص خصوصیات اقتصادی، محیطی، تغذیه­ای یا ارثی وابسته است. قبل از اینکه اصلاح کنندگان، آگاهی و دانش کنونی را کسب نمایند، به طور عمده به مهارت و داوری خود در انتخاب گیاهان جدیدی که به طریق بذر یا رویشی تکثیر می­شد تکیه داشتند. بنابراین انتخاب، قدیمی­ترین شکل اصلاح نبات بود (اسلیپر و پولمن[5]، 1387).

 

اگرچه، گیاهان زراعی در ابتدا به واسطه نتایج جستجوی غیرهدفمند انسان (برای منابع مناسب غذا) رو به تکامل نهادند اما امروزه این امر بیشتر از طریق برنامه­های اصلاحی مدبرانه حاصل می­شود. در حالیکه تغییرات در فعالیتهای زراعی و مکانیزاسیون کشاورزی، تاثیر چشمگیری بر بهره­وری زراعی داشته اند، بهبود عملکرد اغلب گیاهان به سبب بهبود ژنتیکی آنها بوده است. علیرغم پیشرفتهای حاصله، بهبود بیشتر عملکرد و کیفیت محصولات، به سبب رشد جمعیت، افزایش قیمت نهاده­هایی چون آب، کود و انرژی و ملاحظات مربوط به اثرات کودها و سموم شیمیایی بر زیست بوم و تغییر سریع صلایق مصرف کنندگان، مورد درخواست مستمر قرار دارد (دارویس و سولار[6]، 1983). با پیشرفت دانش ژنتیک و سایر علوم گیاهی وابسته، اصلاح نباتات به علم تبدیل گردید. اصلاح نباتات بر پایه­ی تشخیص ژن به عنوان واحد وراثت، روشهای تغییر و تحول ژنی و نقش رفتار ژنتیکی، که امکان برآورد دقیق نتایج حاصل از تغییر و تحول ژنی را می­دهد بنیان نهاده شد. ژنها با آثارشان بر روی ظهور قابل مشاهده­­ی صفات گیاهی نظیر پاکوتاهی یا پابلندی یا رنگ سفید یا صورتی گل شناسایی می­شدند. از طریق دگرگرده­افشانی مهار شده ترکیبات ژنی ویژه­ای از صفات مطلوب مختلف به داخل یک رقم گیاهی ادغام می­گردید.اخیرا دانش ژنتیک مولکولی برای پیشرفت اصلاح نبات، به سطح بالاتری از تکنیک تجربی ارائه گردیده است. ژنتیک مولکولی در توصیف ساختار شیمیایی اسید دی­اکسی­ریبونوکلئیک (DNA)، ماده­ای که سازنده­ی ژن است، مشارکت دارد (اسلیپر و پولمن, 1387).

 

1-6-چرا گیاهان اصلاح می­شوند؟

 

هدف اصلاح نبات تغییر وراثت گیاهی به روش­هایی است که عملکرد گیاهی را بهبود بخشد. بهبود عملکرد گیاهی از راه­های بسیاری مورد عمل قرار می­گیرد. معمولا اهداف اصلی به­نژادی افزایش عملکرد و کیفیت است اگرچه محصول برداشتی دانه، علوفه، الیاف، میوه، غده، گل و یا سایر اندام­های گیاهی باشد، منشا اصلی غذای مردم جهان می­باشند. عملکرد بالاتر محصولات گیاهی تاثیر مهمی در تامین غذای فراوان و سودمندتر شدن کشاورزی و کاهش هزینه­ی محصولات غذایی برای مصرف کننده بر عهده دارند. به­نژادی برای بهبود کیفیت در غذاهای گیاهی، موجب مغذی­تر شدن محصول و افزایش سهولت در تهیه غذا یا کاهش حضور ترکیبات سمی می­گردد. افزایش سلامت گیاه بر اثر به­نژادی، که منجر به مقاومت در برابر بیماری و آفت می­شود، عملکرد و کیفیت محصول را در محیطی با عملیات زراعی مطلوب افزایش می­دهد و مصرف سموم شیمیایی را کاهش می­دهد (اسلیپر و پولمن, 1387).

 

 1-7-تنوع ژنتیکی[7]

 

1-7-1-تنوع ژنتیکی و اهمیت مطالعه آن     

 

تنوع، مبنای همه گزینش­هاست. انتخاب ژنوتیپی نیز نیازمند تنوع می­باشد. با بالا رفتن تنوع ژنتیکی در یک جامعه حدود انتخاب چه در انتخاب طبیعی و چه بطور مصنوعی وسیع­تر می­شود. با توجه به رابطه مثبت دربین کمیت تنوع ژنتیکی و مقدار وقوع تغییرات تکاملی در آن رابطه مشابهی نیز در بین کارایی بهبود ژنتیکی اصلاح یک جامعه و تنوع ژنتیکی برای صفت مورد علاقه موجود است (عبد­میشانی و شاه­نجات­بوشهری، 1376).

 

جایگزینی ارقام محلی توسط ارقام جدید و خالص (و تولید وسیع یک رقم برتر) تنوع ژنتیکی را در برنامه­های زراعی کاهش داده است. خطری که وجود دارد این است که برای برنامه­های اصلاحی آینده ممکن است با روند توسعه صنعتی و کشاورزی فشرده در مناطق تنوع ژنتیکی، منابع ژنتیکی ارزشمند از دست بروند (رنجبر، 1386).

 

تنوع بین گیاهان یک گونه خاص بر دو نوع است، تنوع بر اثر محیط که گیاه به مقادیر مختلف تنش محیطی واکنش می­دهد و با مقایسه گیاهان دو جمعیتی که از لحاظ ژنتیکی یکنواخت هستند، می­توان آنرا مشاهده نمود. تاثیر محیط روی یک گیاه، به نتاج آن منتقل نمی­شود و بنابر این نژاد­های انتخاب شده واکنش یکسانی به تنش­های محیطی خواهند داشت. دسته دوم تنوع ارثی است، این نوع تنوع، به تنوع موجود در یک جمعیت مخلوط ژنتیکی، که از عوامل ارثی ناشی شده و به نتاج انتقال می­یابد، اطلاق می­گردد. از آنجا که این نوع تنوع، ناشی از عوامل ارثی است و قابلیت انتقال به نتاج را دارد، لذا در اصلاح نباتات و برنامه­های اصلاحی حائز اهمیت است. منشاء تنوع ارثی در گیاهان نوترکیبی­های ژنتیکی، تغییرات در کروموزوم­ها و جهش[8]­ها می­باشد (محسنی­فرد، 1386).

 

تنوع موجود در یک ژرم­پلاسم می­تواند، منجر به ارقام بهتر و همچنین استفاده از این تنوع در جهت بهبود خصوصیات رقم زراعی گردد (ارزانی، 1380). طراحی و اجرای یک برنامه اصلاح نباتات برای اصلاح یک صفت کمی، تا حد زیادی به میزان تنوع ژنتیکی ژرم­پلاسم بستگی دارد. مطالعه پلی­مورفیسم در میان ژرم­پلاسم، فرصت گزینش والدین مناسب جهت تلاقی را فراهم می­آورد. انتظار می­رود این والدین در تلاقی با هم نتاج برتری تولید کرده و میانگین صفات را در جمعیت بالا ببرند. همچنین بررسی تنوع ژنتیکی و تعیین فاصله ژنتیکی نسبی موجود بین افراد یا جمعیت­ها در برنامه­های اصلاحی اهمیت ویژه­ای دارد، زیرا سازماندهی ژرم­پلاسم و گزینش، بطور موثری انجام می­شود. در آغاز یک برنامه اصلاحی، آگاهی از روابط خویشاوندی و فیلوژنی در میان ژنوتیپ­ها تکمیل کننده اطلاعات فنوتیپی، در پیشبرد اصلاحی جمعیت­ها است. همچنین اطلاع از شباهت­های ژنتیکی در بین ژنوتیپ­ها موجب می­شود انتخاب والدین در یک تلاقی، بطور موثرتری انجام پذیرد (نلی[9] و همکاران، 1999).

 

 1-7-2-فرسایش ژنتیکی[10]

 

از بین رفتن منابع ژنتیکی یا ذخایر توارثی را فرسایش ژنتیکی گویند (فارسی و باقری, 1383). امروزه ذخایر توارثی گیاهی مهمترین، پرارزش­ترین و حیاتی­ترین ذخایر منابع طبیعی بشر محسوب می­گردند و ارزش مادی و معنوی آنها به هیچ عنوان با سایر ذخایر و منابع طبیعی قابل مقایسه نمی­باشد (وجدانی, 1372). در حدود سال 1950 این نظریه قوت گرفت که منابع ژنتیکی طبیعی به سرعت در حال تخریب می­باشند و یا به اصطلاح فرسایش ژنتیکی اتفاق می­افتد. در حقیقت، فرسایش ژنتیکی در طول ده­ها سال بر اثر سرعت زیاد در تخریب منابع ژنتیکی تداوم یافته است و اگر با همان سرعت پیش می­رفت تا سال 2000 مخازن ژرم­پلاسم طبیعی همه نابود شده بودند (اسمال[11]و همکاران، 1995). بنابراین گیاهان با تمام ارزش­های مادی که برای بشر دارند متاسفانه به دلیل سیستم­های دفاعی ضعیف خود تحت تاثیر عوامل فرساینده منابع ژنتیکی متعددی قرار گرفته و به سرعت به زوال و نابودی کشیده می­شوند.

 

از مهمترین عوامل فرساینده منابع ژنتیکی می­توان به سوانح طبیعی مانند سیل، آتش­سوزی، چرای بی­رویه حیوانات، بهره­برداری بی­رویه بشر از درختان جنگلی، توسعه شهرنشینی و صنعت، توسعه شبکه راههای مختلف و امکانات حمل و نقل، توسعه کشاورزی مدرن و جایگزینی ارقام اصلاح شده به جای ارقام بومی، اثرات سوء استفاده از نهاده­های کشاورزی مثل سم و کود و بالاخره اثرات سوء استفاده از ماشین­آلات سنگین بر روی بافت خاک و پوشش گیاهی اشاره نمود (وجدانی, 1372).

 

1-7-3-حفاظت از ذخایر توارثی

 

ایجاد ارقام برتر از نظر زراعی که به افزایش تولید گندم کمک کرده­اند، بدون استفاده از تنوع ژنتیکی امکان­پذیر نبوده است. آنچه مسلم است این می­باشد که موفقیت آینده متخصصان اصلاح نباتات به حفظ ذخایر ژنتیکی امروز بستگی دارد تا بتوانند از آن در برنامه­های آتی اصلاحی خود استفاده کنند. اصلاح نباتات در صورتی شانس موفقیت در برنامه­های اصلاحی خود را دارد که امکان انتخاب مواد مناسب و تنوع وجود داشته باشد. از طرفی دیگر عوامل فرساینده ژنتیکی مختلفی باعث حذف و نابودی این ثروت خدادادی و پر ارزش شده­اند، بنابراین سرمایه­گذاری برای ایجاد کلکسیون­های گیاهی و بانک­های ژن به منظور حفظ و نگاه­داری دائمی ذخایر توارثی گیاهی ضروری است. هدف کلی بانک­های ژن حفظ و نگهداری دائمی ذخایر توارثی گیاهی و فراهم آوردن امکانات بهره­برداری هر چه بیشتر و مفیدتر آنها و جمع آوری اطلاعات مربوط به بانک­های ژن برای استفاده اصلاح کنندگان نباتات در جهت پیشبرد اهداف تحقیقات کشاورزی می­باشد و وظایف آنها را می­توان به صورت زیر خلاصه نمود:

 

مطالعات و بررسی­های اولیه مشتمل بر تنوع ژنتیکی و پراکنش جغرافیایی گونه­ها

 

جمع آوری نمونه­های بذری و گیاهی از ارقام بومی و خویشاوندان وحشی گیاهان

 

حفاظت و نگاهداری ذخایر توارثی گیاهی

 

احیا و ارزیابی منابع ژنتیکی گیاهان جمع­آوری شده

 

ثبت کامپیوتری اطلاعات موجود (فضل­آبادی, 1384).

 

1-7-4-هتروزیس[12]

 

یک فرد هتروزیگوت که از تلاقی دو والد نامشابه به دست می­آید، هیبریدی است که معمولا رشد زیاد و هیکل قوی دارد. این رشد عالی تحت عنوان هتروزیس بیان می شود. بنابراین هتروزیس پدیده­ای است که هیبرید دو والد نامشابه حداقل نسبت به میانگین والدین، جثه و بنیه بهتری نشان می­دهد. هتروزیس پدیده­ای است معمول در گونه­های دگربارور، و در بعضی از گیاهان خودبارور هم گزارش شده است. کلمه هتروزیس یک کلمه یونانی است که از دو کلمه Heteros به معنی اختلاف و Osis به معنی حالت گرفته شده است. هتروزیس دقیقا عکس پدیده­ی پسروی یا انحطاط ناشی از خویش­آمیزی است که غالبا در گیاهان دگر بارور مشاهده می­شود (فارسی و باقری, 1383).

 

در زمان انتخاب روش اصلاحی سطح و میزان هتروزیس موجود برای یک صفت بایستی مد نظر قرار گیرد. هتروزیس ابتدا به صورت موفقیت­آمیز در ذرت استفاده شد، اما اکنون در بسیاری از گیاهان دگربارور و خودبارور از پدیده هتروزیس و تولید بذر هیبرید استفاده می­شود. در تهیه هیبریدهای برتر هرچه دو لاین والدینی از نظر ژنتیکی از هم دورتر باشند، میزان هتروزیس درF1 بیشتر است، بنابراین می­توان لاین­های مورد بررسی را به گروه­های نامشابه مورد اعتمادی تقسیم کرد و در نتیجه از تعداد تلاقی­هایی که باید انجام و بررسی شوند به طور چشمگیری کاسته می­شود (نبیپور و همکاران، 1386). همچنین با توجه به اینکه آفتابگردان دو­رگ عملکرد بیشتری از لاین­های اینبرد دارد، لزوم تعیین تنوع ژنتیکی در این گیاه از اهمیت ویژه­ای برخوردار است و استفاده از روش­های جدید ارزیابی ژنتیکی به منظور انتخاب والدین دورگ و تعیین میزان قرابت ارقام ضروری می­باشد (غفاریپور و همکاران، 1384).

 

اصلاح نباتات، بعنوان فرآیند مورد استفاده در طی قرن­ها، به میزان زیادی به گزینش صفات مطلوب بستگی دارد. این گزینش­ها اغلب شامل چرخه­های متعدد اصلاحی به منظور انتقال خصوصیات مطلوب زراعی و کیفی از والدین متفاوت به یک ژنوتیپ منفرد می­باشند. پیشرفتهای جدید در بیوتکنولوژی منجربه توسعه ابزارهای بدیعی که نوید بخش اصلاح نباتات سریعتر و دقیق­تر می­باشند شده است. در این میان، مارکرهای مولکولی نوید بخش­ترین ابزارها هستند. مارکرهای مولکولی قطعاتی از DNA گیاه هستند که اصلاح­گران برای تشخیص حضور و یا عدم حضور آللهای مورد علاقه در گیاهان مورد آزمایش بکار می­برند و بنابراین از آنها بعنوان ابزارهای گزینش بهره می­برند. گزینش گیاهان مطلوب برپایه مارکرهای متصله را در اصطلاح گزینش به کمک مارکر می­نامند. با استفاده از مارکرهای مولکولی، اصلاح­گران می­توانند روش­های گزینش بر پایه فنوتیپ که شامل گیاهان در حال رشد تا گیاهان بالغ است را کوتاه­تر ساخته و خصوصیات فیزیکی آنها را به منظور آگاهی از ساختار بنیادین ژنتیکی آنها مورد بررسی دقیق قرار دهند) انشری[13] و همکاران، 2004).

 

 1-8-نشانگرهای مولکولی[14]

 

مفهوم نشانگر ژنتیکی[15] موضوع جدیدی نمی­باشد .در قرن نوزدهم، گرگور مندل نشانگرهای ژنتیکی مبتنی بر فنوتیپ را در ازمایش­های خود به کار برد. پس از آن نشانگر ژنتیکی مبتنی بر فنوتیپ برای مگس سرکه[16] منجر به پیدایش نظریه پیوستگی ژنی شد. این مفهوم زمانی تحقق می­یابد که مکان­های ژنتیکی نزدیک به هم، همزمان و با هم به ارث برده می­شوند (موندینی[17] و همکاران، 2009).

١-میکرواسپرما : با بذرهای ریز گرد به قطر ٢ تا ٦ میلیمتر که رنگ پوسته بذر آن از زرد کمرنگ تا سیاه متغیر است.

 

٢-ماکرواسپرما : در این گروه بذرهای بزرگ­تر و پهن­تر هستند و رنگ پوسته بذر سبز کمرنگ است. این گروه از گیاهان دارای غلاف­ها و برگچه­های بزرگ­تری نسبت به گروه قبلی هستند. بطور کلی گیاهان میکرواسپرما قدیمی­تر بوده و گیاهان ماکرواسپرما از میان آنها انتخاب شده­اند.

 

عدس نسبت به سایر حبوبات دارای مدت پخت کوتاه­تری است و راحت­تر هضم می­گردد (وب و هوتین، ١٣٧٦). عدس در رفع یبوست و اختلالات روده­ای مفید است، همچنین در جلوگیری از سکته نیزموثر می­باشد. مرهم خمیر عدس جهت التیام زخم­های باقی مانده از آبله در طب سنتی توصیه شده است (مجنون ­حسینی، ١٣٨٧). مقدار پروتئین عدس با باقلا برابر و از نخود بیشتر است. عدس سرشار از آهن است و همچون باقلا و نخود منبع خوبی برای تیامین و نیاسین بوده، اما از نظر ویتامین B و کاروتن نسبتا فقیر است (نامدار و همکاران، ١٣٧٤). اگرچه عدس اساسا در تغذیه انسان استفاده می­شود ولی از آن در تغذیه حیوانات به ویژه ماکیان نیز استفاده می­گردد. کاه و دیواره­های غلاف و بقایای ناشی از کوبیدن آن از ارزش تغذیه­ای زیادی برای دام برخوردارند (وب و هوتین، ١٣٧٦).

 

عدس یکی از قدیمی­ترین گیاهان زراعی است که منشاء آن خاک­های حاصلخیز خاور نزدیک می­باشد. قدمت این گیاه به شروع کشاورزی باز می­گردد. در مقبره فراعنه مصر آثار خمیری محتوی عدس پخته بدست آمده است. نویسندگان یونانی در آثار خود به نام عدس اشاره داشته­اند و به نظر می­رسد که این گیاه به عنوان هدیه­ای برای خدایان مورد استفاده قرار می­گرفته است. رومیان نیز ارزش زیادی برای عدس قائل بوده­اند به­طوری که آن را از مصر وارد می­کرده­اند (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥). نام عدس در کتاب­های مقدس دینی نظیر انجیل و قرآن ذکر شده است. در قرآن (سوره بقره) عدس یکی از محصولات زمینی بوده

 

که یهودیان از موسی(ع) خواستند که از خداوند برایشان درخواست نماید (وب و هوتین، ١٣٧٦). یکی از قدیمی­ترین آثار گیاهان خوراکی بقایای عدس است که مربوط به ٧٥٠٠ تا ٨٥٠٠ سال قبل از میلاد مسیح می­باشد (پارسا و باقری، ١٣٨٧).

 

به نظر می­رسد که عدس در منطقه­ای بین جنوب­غربی ترکیه و ترکمنستان از نژادهای وحشی خود اهلی شده است و به سمت نیل، یونان، اروپای مرکزی و متعاقب آن به سمت دانوب گسترش یافته باشد. بر اساس نظریه­های موجود عدس به دلیل نیازهای متفاوت اکولوژیکی موجود در گونه­های وحشی، پراکنش متفاوتی داشته و به مناطقی با شرایط مدیترانه­ای و همچنین در نواحی کوهپایه­ای جنوب­غربی آسیا سازگار شده است (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥).

 

اصلاح کنندگان نباتات که در جهت دست­یابی به تنوع ژنتیکی موجود در کلکسیون ژرم­پلاسم فعالیت می­کنند، نیاز به داشتن اطلاعاتی در مورد میزان تنوع دارند. عملیات اصلاحی در عدس در مقایسه با سایر محصولات مهم زراعی از قدمت کمتری برخوردار است و فعالیت نسبتا جدیدی است. بهبود در عدس عمدتا بر اساس معرفی مواد انتخاب شده برای سازگاری به نواحی خاصی بوده است. در نتیجه بیشتر ارقام مورد استفاده امروزی بر اثر انتخاب در جمعیت­های نامتجانس بدست آمده و از عملیات هیبریداسیون استفاده نشده است. پیشرفت با استفاده از این روش محدود به تنوع موجود در این توده­ها و پیشرفت­های اصلاحی بعدی بستگی به هیبریداسیون و انتخاب خواهد داشت. کلکسیون­هایی برای حفاظت از ژرم­پلاسم عدس در آمریکا، هندوستان و سوریه ایجاد شده و از این نظر که تنوع ژنتیکی مورد نیاز برنامه­های اصلاحی هیبریداسیون را فراهم می­کند ارزشمند است.

 

با استفاده از روش­های انتخاب توده­ای والدین خالص در داخل ژرم­پلاسم یا نژادهای بومی می­توان به سهولت و سرعت به پیشرفت­های قابل توجهی دست یافت. این رو­ش­ها می­توانند در کوتاه مدت نیاز به واریته­های اصلاح شده و همچنین مواد ژنتیکی یکنواخت مورد نیاز در برنامه­های هیبریداسیون را فراهم کنند.

 

انتخاب توده­ای دو نوع گزینش را دربر می­گیرد :

 

١-حذف تیپ­های نامطلوب از یک مخلوط یا جمعیت­های متنوع و برداشت گیاهان باقی­مانده به صورت مخلوط.

 

٢-شناسایی تیپ­های برتر در جمعیت از طریق علامت­گذاری و یا هر روش دیگر و برداشت آنها به صورت مخلوط، نتیجه نهایی این دو روش کاهش فراوانی ژنوتیپ­های نامطلوب و افزایش فراوانی ژنوتیپ­های مطلوب خواهد بود.

 

انتخاب توده­ای ممکن است در هر نوع از منبع ژنتیکی (مثل نژادهای بومی، جمعیت­های هیبرید) که دارای تغییرات ژنتیکی کافی باشد و موفقیت را تضمین کند انجام شود (وب و هوتین، ١٣٧٦).

 

از آنجا که تنوع، اساس هر برنامه اصلاحی است، به طوری که موفقیت یک برنامه اصلاحی به طبیعت و یا حجم و تنوع موجود در مواد ژنتیکی بستگی دارد. وجود حداکثر تنوع، بزرگترین شانس برای نائل شدن به موفقیت در گزینش محسوب می­شود (میشرا و همکاران، ٢٠٠٧). با توجه به این که ایران یکی از مراکز تنوع عدس در جهان بوده و حتی پراکندگی دو گونه وحشی آن (Lens cyanea و Lens orientalis) نیز گزارش شده است (آقایی و همکاران، ١٣٨٣)، انتظار می­رود تنوع زیادی در میان توده­های بومی این محصول یافت شود. تنوع ژنتیکی بین و داخل جمعیت­های گونه­های گیاهی، یکی از موارد اصلی مورد مطالعه به­نژادگران و متخصصان ژنتیک می­باشد (هایوارد و بریز، ١٩٩٣). مور و کولینز دریافتند که توجه به ژرم­پلاسم گیاهان در طول نگهداری آنها، جهت پیش­بینی پتانسیل ژنتیکی و استفاده از آن در برنامه­های اصلاحی ضرووری است (مور و کولینز، ١٩٩٣). در استان خراسان شمالی عدس با سطح کشت ٢١٣١٢ هکتار که ٢٠٩٠٠ هکتار آن دیم می­باشد و با مقدار تولید ٨٣٦٣ تن بیشترین تولید و سطح کشت در بین سایر حبوبات را به خود اختصاص داده است که این مطلب خود بیان کننده جایگاه ویژه این محصول در استان می­باشد. با توجه به اهمیت گیاه عدس، انجام اقدامات اصلاحی در آن امری بسیار مهم می­باشد.

 

١-٢-پرسش تحقیق

 

آیا امکان بررسی تنوع ژنتیکی توده­های بومی عدس استان خراسان شمالی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR وجود دارد؟

 

آیا در بین توده­های مورد بررسی تنوع ژنتیکی وجود دارد؟

 

 ١-٣-اهداف تحقیق

 

ارزیابی امکان استفاده از نشانگر مولکولی ISSR در بررسی تنوع ژنتیکی عدس

 

بررسی تنوع ژنتیکی توده­های عدس مورد بررسی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR

 

تعیین میزان فاصله ژنتیکی بین توده­های مورد بررسی و استفاده از اطلاعات به دست آمده در مراکز تحقیقاتی

 

١-٤-فرضیه­ها:

 

تنوع ژنتیکی بین توده­های بومی عدس استان خراسان شمالی وجود دارد.

 

برای تشخیص تنوع ژنتیکی عدس، می­توان از نشانگرهای مولکولی استفاده کرد.

 

روش ISSR روش مناسبی برای بررسی تنوع ژنتیکی است.

 

 ١-٥-هنر و دانش اصلاح نباتات

 

هنر اصلاح نبات به مهارت اصلاح کننده در مشاهده و تشخیص خصوصیات اقتصادی، محیطی، تغذیه­ای یا ارثی وابسته است. قبل از اینکه اصلاح کنندگان، آگاهی و دانش کنونی را کسب نمایند، به طور عمده به مهارت و داوری خود در انتخاب گیاهان جدیدی که به طریق بذر یا رویشی تکثیر می­شد تکیه داشتند. بنابراین انتخاب، قدیمی ترین شکل اصلاح نبات بود (اسلیپر و پولمن، ١٣٨٧).

 

اگرچه، گیاهان زراعی در ابتدا به واسطه نتایج جستجوی غیرهدفمند انسان (برای منابع مناسب غذا) رو به تکامل نهادند اما امروزه این امر بیشتر از طریق برنامه های اصلاحی مدبرانه حاصل می شود. در حالیکه تغییرات در فعالیتهای زراعی و مکانیزاسیون کشاورزی، تاثیر چشمگیری بر بهره­وری زراعی داشته اند، بهبود عملکرد اغلب گیاهان به سبب بهبود ژنتیکی آنها بوده است. علیرغم پیشرفت­های حاصله، بهبود بیشتر عملکرد و کیفیت محصولات، به سبب رشد جمعیت، افزایش قیمت نهاده­هایی چون آب، کود و انرژی و ملاحظات مربوط به اثرات کودها و سموم شیمیایی بر زیست­بوم و تغییر سریع سلایق مصرف کنندگان، مورد درخواست مستمر قرار دارد (دروسی و سالر،١٩٨٣؛ بکمن و سولر، ١٩٩٤). با پیشرفت دانش ژنتیک و سایر علوم گیاهی وابسته، اصلاح نباتات به علم تبدیل گردید. اصلاح نباتات بر پایه­ی تشخیص ژن به عنوان واحد وراثت، روش­های تغییر و تحول ژنی و نقش رفتار ژنتیکی، که امکان برآورد دقیق نتایج حاصل از تغییر و تحول ژنی را می­دهد بنیان نهاده شد. ژن­ها با آثارشان بر روی ظهور قابل مشاهده­­ی صفات گیاهی نظیر پاکوتاهی یا پا بلندی یا رنگ سفید یا صورتی گل شناسایی می­شدند. از طریق دگرگرده­افشانی مهار شده ترکیبات ژنی ویژه­ای از صفات مطلوب مختلف به داخل یک رقم گیاهی ادغام می­گردید. اخیرا دانش ژنتیک مولکولی برای پیشرفت اصلاح نبات، به سطح بالاتری از تکنیک تجربی ارائه گردیده است. ژنتیک مولکولی در توصیف ساختار شیمیایی DNA، ماده­ای که سازنده­ی ژن است، مشارکت دارد (اسلیپر وپولمن, ١٣٨٧).

 

١-٦-چرا گیاهان اصلاح می­شوند؟

ـ دیابت حاد : میزان قند خون به مقدار خطرناكی بالا می‌رود. ممكن است در اثر مصرف دارو (انسولین) قند خون به میزان غیر طبیعی كاهش یابد.

 

ـ دیابت مزمن : با افزایش قند خون در زمان‌های طولانی گرفتگی رگ‌های خونی (كوچك و بزرگ) به وجود می‌آید؛ كه باعث آسیب چشم، كلیه، قلب و اعصاب می‌شود.

 

درمان دیابت بستگی به نوع و شدت آن دارد. دیابت نوع I با مصرف انسولین، ورزش و رژیم غذایی مخصوص افراد دیابتی درمان می‌شود(طهوری زهرا؛ بیگدلی فاطمه ،1391 دیابت(مرض قند ) چاپ اول ، ناشر آسمان علم ).

 

دیابت نوع II ابتدا با كاهش وزن، رژیم غذایی مخصوص افراد دیابتی و ورزش درمان می‌شود. در صورتی كه این اقدامات قادر به كنترل میزان بالای قند خون نباشد از داروهای خوراكی استفاده می‌شود. چنانچه داروهای خوراكی نیز بی‌تأثیر باشد مصرف انسولین مورد توجه قرار می‌گیرد.

 

دیابت چیست؟

 

دیابت ملیتوس (Mellitus diabet)

 

) گروهی از بیماری‌های متابولیكی هستند كه ویژگی آنها میزان بالای قند خون می‌باشد كه علت بروز آن‌ها نقص در ترشح انسولین یا عملكرد آن یا هر دو می‌باشد. این بیماری را یونانیان نامگذاری كردند. دیابت در زبان یونانی به معنای تخلیه كردن است كه در این‌جا افزایش ترشح ادرار را منعكس می‌كند و ملیتوس به معنای شیرین همچون عسل و در این‌جا نشانه‌ی گلوكز موجود در ادرار است.

 

ملیتوس دیابت، كه معمولاً دیابت نامیده می‌شود در گذشته ابتدا به عنوان نوعی بیماری كه علائم آن ادرار شیرین و كاهش شدید توده‌ی ماهیچه‌ای بود شناخته شد. افزایش میزان قند خون باعث نفوذ گلوكز به داخل ادرار می‌شود، به همین دلیل آن را در اصطلاح ادرار شیرین می‌نامند

 

میزان گلوكز به طور طبیعی تحت كنترل شدید انسولین قرار دارد، كه نوعی هورمون است كه توسط غده‌ی لوزالمعده تولید می‌شود. انسولین موجب كاهش میزان قند خون می‌باشد.

 

هنگامی كه میزان قند خون بالا می‌رود مثلاً بعد از صرف غذا انسولین از لوزالمعده ترشح می‌شود تا سطح گلوكز خون را به میزان طبیعی نگاه دارد، در بیماران مبتلا به دیابت فقدان یا تولید ناكافی انسولین موجب افزایش میزان قند خون می‌شود. دیابت نوعی بیماری مزمن است؛ به این معنا كه هر چند می‌توان آن را كنترل نمود اما تا پایان عمر باقی می‌ماند.

 

دیابت قندی، بیماری نسبتاً شایعی است كه حاصل كمبود ترشح یا عملكرد انسولین می‌باشد( کاتولوگ دیابت بریتانیا ؛ مارس 2009 ، هایپوگلدسیما ، اطلاعات دیابت ).

 

دیابت چه تأثیراتی روی فرد بیمار می‌گذارد؟

 

ممكن است دیابت به زمان باعث نابینایی، نارسایی كلیوی و آسیب به اعصاب گردد. این آسیب‌ها در نتیجه‌ی صدمه به رگ‌های كوچك ایجاد می‌شود كه به آن بیماری مویرگی گفته می‌شود. همچنین دیابت عامل مهمی در تسریع سختی و تنگی عروق (آتریواسکلروزیس) می‌باشد كه منجر به سكته، انسداد شریان قلب و سایر بیماری‌های مربوط به رگ‌های بزرگ خونی می‌شود.

 

عوارض مزمن دیابت را می‌توان به سه گروه عمده تقسیم نمود:

 

 

1. عوارض عروق موئین (میكروآنژیوپاتی)

 

1. ابتلاء عروق بزرگ ـ بیماری های عروض بزرگ (آرتریواسكروز)

 

1. عوارض عصبی

 

ـ عوارض عروق موئین: ابتدا در عروق موئین بیشتر در چشم و كلیه تظاهر می‌كنند. حدود 80 تا 90 درصد بیماران دیابتی بعد از 25 سال به رتینوپاتی و 40 درصد آنها به نفروپاتی مبتلا خواهند شد() کاتولوگ دیابت بریتانیا ؛ مارس 2009 ، بیماریهای قلبی و عروقی ، اطلاعات دیابت ).

 

چشم : تظاهرات ابتلاء چشم در دیابت عبارتند از: اختلال زودگذر بینایی (عیب انكسار + كاتاراكت).

 

تاری دید، معمولاً عارضه‌ی خوش‌خیمی است كه از تغییر سریع اسموز عدسی چشم ناشی می‌شود. این مشكل پیش دیابتیك‌های تیپ I كه برای آن‌ها درمان با انسولین شروع می‌شود بیشتر گزارش شده است.

 

كاتاراكت: در بررسی چشم ایجاد اشكال می‌كند.

 

رتینوپاتی: با پیدایش عروق جدید باعث خونریزی و كوری می‌شود( عبدالله نژاد؛ گل ع، 1388 ، اثر سیر بر آسیب بیضه موشهای دیابتی شده صحرایی نر مجله غدد درون ریز و متابولیسم ایران شماره 4 ).

 

 كلیه:

 

كلیه به یكی از دلایل زیر در دیابت دچار مشكل می‌شود:

 

آرترواسكروز ـ نفروپاتی ـ افزایش فشار خون ـ آتونی مثانه ـ نكروز پاپیلر كلسیم ـ پیلونفریت و عفونت‌های اداری (رجبیان رضا ؛ 1370 دیابت ، انتشارات دانشگاه علوم پزشکی مشهد).

 

چگونگی افزایش ادرار:

 

مرحله اول: هیپوتروفی و پركاری كلیه

 

در زمان تشخیص دیابت وابسته به انسولین معمولاً اندازه كلیه‌ها و فیلتراسیون گلومرولی (Glomerol Filtreation Rate) اضافه شده است. این مرحله با تنظیم دقیق قند خون قابل برگشت می‌باشد.

 

مرحله دوم: افزایش غشای پایه در كپسول بومن

 

دو تا سه سال پس از تشخیص دیابت غشای پایه در كپسول بومن به طور قابل ملاحظه‌ای افزایش می‌یابد. حجم مزانشیم گلومرولی هم افزایش می‌یابد. مواد پروتئینی، IgG ، فیبرین و محصولات دگراداسیون پلاكتی عمده رسوبات را تشكیل می‌دهند.

 

در این مرحله فیلتراسیون گلومرولی هنوز بالاست و آلبومین اوری وجود ندارد. باید توجه داشت كه ضخامت غشای پایه نشانه پروتئین اوری نمی‌باشد.

1-1-1-آب و هوای دریای خزر

 

آب و هوای دریای خزر دارای تغییراتی می باشد، در قسمت شمالی و سواحل آن در زمستان هوا بسیار سرد تا 38 درجه زیر صفر می رسد و قشر نسبتا کلفتی از یخ، آبهای حاشیه ساحلی و دلتاهای ولگا و اورال را می پوشاند. اما در جنوب به عکس شمال برف و سرمای شدید نادر است. کرانه های شمال و شرق دریا آب و هوای خشکی دارند میزان بارندگی سالانه در این قسمت بین 200-100 میلیمتر است. متوسط درجه حرارت در دی ماه بین هفت تا ده درجه زیر صفر می باشد و در تابستان گرم می شود. متوسط درجه حرارت در تیرماه 26-25 درجه می رسد و نمونه کاملی از آب و هوای بری در این قسمت حاکم است. در قسمت میانی دریا اعم از سواحل و اعماق، متوسط درجه حرارت در دیماه از پنج درجه زیر صفر تا پنج درجه بالای صفر است و درجه متوسط حرارت در تیرماه بین 26-25 درجه می باشد. میزان بارندگی سالانه در شرق و قسمت میانه دریا از 100 تا 140 میلیمتر است و نقطه مقابل آن در غرب تا 2000 میلیمتر بارندگی دارد. در کرانه های جنوبی دریای خزر دو نوع آب و هوا تشخیص داده شده است آب و هوای گرم و مرطوب در باختر و جنوب باختری که درجه حرارت متعادل و ریزش بارانهای بهاری و پائیزی از خصائص این نوع آب و هوا است و آب و هوای مدیترانه ای که در بخش خاوری کرانه های جنوبی دریای خزر وجود دارد. میزان بارندگی سالانه در بخش جنوبی دریای خزر از غرب به شرق متغیر است بطوریکه هر قدر از غرب به طرف شرق حرکت کنیم مقدار آن کاهش می یابد (بریمانی،1355).

 

1-1-2- ماهیان دریای خزر                                                                                              

 

   در دریای خزر 120 گونه و زیر گونه مختلف ماهیان شناسایی شده است (کاسیموف و رحیموف، 1993). با ارزشترین آنها عبارتند از: فیل ماهی، تاسماهی، ازون برون، شیپ، ماهی آزاد، ماهی سفید، سوف، ماش، کلمه، شگ ماهی و غیره می باشد. اجتماع بزرگ ماهیان دریای خزر از نظر تعداد گونه و زیر گونه شامل : شگ ماهیان 18 گونه و زیر گونه کپور ماهیان 23 گونه و زیر گونه گاو ماهیان 36 گونه و زیر گونه می شود که در مجموع 77 درصد کل ماهیها را تشکیل می دهد. در بین ماهیان حوزه دریای خزر فقط شگ ماهیان و گاو ماهیان دریائی محسوب می شوند زیرا کپور ماهیان در خلیج ها و تالاب ها زندگی و تغذیه می کنند. بخش قابل توجه ایکتیوفان دریای خزر را ماهیان نوع آب شیرین تشکیل می دهند و به آنها انواع تاسماهیان کپورماهیان اردک ماهی اسبله سوف ماهیان و….مربوط می شوند(کازانچف، 1981). ماهیان دریائی عموما در بخش میانی و جنوبی دریای خزر تغذیه می کنند غذای آنها را دتریت ،زئوپلانکتونها و نکتوبنتوزها تشکیل دهند. لیکن بعضی اوقات شگ ماهیان تا عمق 100 متری کیلکاها تا عمق 200 متری و گاوماهیان تا 600 متری نیز پائین می روند. صید ماهی در دریای خزر طی سالهای 1932 تا 1991 بطو متوسط از 797/323 تا961 /528 هزار تن بوده است(کاسیموف ،1994).                                                                                                

 

1-1-3-ماهیان حوضه جنوبی دریای خزر

 

     حوضه جنوبی دریای خزر با داشتن بیش از 98 گونه ماهی از 18 خانواده یکی از متنوع ترین زیستگاههای آبی به لحاظ داشتن تعداد گونه ماهی در کشور ایران می باشد محدوده جغرافیائی این حوضه شامل رودخانه ها تالابها و سواحل جنوبی دریای خزر از ناحیه شمال شرق تا ناحیه شمال غرب ایران می باشد. در این ناحیه طبق اخرین بررسیهای انجام شده تا کنون 98 گونه ماهی شناسائی گردیده که متعلق به 18 خانواده و 58 جنس می باشد . در این میان 7/33 درصد از گونه ها (24 جنس و 33 گونه) متعلق به خانواده کپور ماهیان و 4/21 درصد گونه ها (9 جنس و 21 گونه) متعلق به خانواده گاوماهیان می باشد. نه خانواده (دهان گردان، مارماهیان مهاجر، اردک ماهیان، اسبله، ماهیان گادیده، شیشه ماهیان، سوزن ماهیان ،کفشک ماهیان ،گامبوزیا ماهیان) هر یک دارای یک جنس و یک گونه می باشند. خانواده سگ ماهیان جویباری شامل سه جنس و ده گونه اند خانواده تاسماهیان شامل دو جنس و پنج گونه خانواده شگ ماهیان دو جنس و هشت گونه خانواده آزادماهیان سه جنس و چهار گونه خانواده ماهیان سه خاره شامل سه جنس و دو گونه و خانواده سوف ماهیان و کفال ماهیان هر یک دارای دو جنس و سه گونه می باشد 35 گونه ماهی مهاجر (از دریا به رودخانه)،49 گونه ساکن در آب شیرین (رودخانه ها و تالابها) و 14 گونه نیز ساکن در آب لب شور می باشند(عبدلی، 1371). بر اساس برخی عوامل مشخص مانند احداث کانال ولگا- دن و برخی عوامل نامشخص دیگر تا کنون چهار گونه ماهی جدید در جنوب دریای خزر یافت شده است (هولچیک و رضوی 1992، کد و عبدلی 1993).  

 

1-1-4- اختصاصات اکولوژیکی دریای خزر

 

آبزیانی که در دریاچه خزر زندگی می کنند تحت تاثیر فاکتورهای اکولوژیکی متفاوت که بر روی فلور و فون موثر می باشند، قرار دارند. تحت تاثیر فاکتورهای اکولوژیکی، گسترش یا کاهش منطقه زیستی گونه ها اتفاق می افتد. بنابراین فاکتورهای اکولوژیکی بعنوان عوامل موثر می باشند که به رشد و تولید انبوه یا توقف رشد گونه های خاص در مناطق زندگی انها منجر می گردد (کاسیموف، 1994).

 

1-2- خلیج گرگان

 

1-2-1- موقعیت جغرافیایی خلیج گرگان

 

خلیج گرگان بین عرض جغرافیایی 45،37،36 و طول جغرافیایی 54،5،53 واقع شده است. مساحت کلی آن 400 کیلومتر مربع می باشد شکل آن سه گوش بوده و طول آن حدود 60 کیلومتر و بیشترین پهنای آن 12 کیلومتر است. خلیج از شرق به غرب کشیده شده و راس آن در غرب قرار داشته و حاشیه باریک و دراز میانکاله آن را جدا می سازد. بیشترین عمق آن در حوالی جنوب شرقی و 5 متر و کمترین آن در ناحیه غربی در حدود 1 متر می باشد. اتصال خلیج با دریا در گذشته به وسیله 4 کانال متشکل از 3 جزیره آشوراده و شبه جزیره میانکاله بوده است ولی امروزه تنها یک کانال در بین بندرترکمن و راس شبه جزیره یعنی همان جزیره کوچک آشوراده قرار دارد بقیه کانال های مزبور به دلیل پایین آمدن سطح آب دریا خشک گردیده و جزایر آشوراده به شبه جزیره میانکاله متصل گردیده اند و دیگر جزیره ای وجود ندارد. دهانه خلیج باریک و اندازه آن 700 متر است که در جهت شرق با دریا در ارتباط است. جنوب و غرب خلیج، دشت وسیعی قرار دارد که بیتشر ان را زمین های زراعی و دامداری فراگرفته است. بستر خلیج در قسمت های شرقی-جنوبی و غربی باتلاقی است و رودخانه های کوچک زیادی که از کوه های جنوبی سرچشمه می گیرند به آن میریزد مهمترین رودخانه هایی که خلیج گرگان می ریزند عبارتند از:

 

قره سو در شرق، گز، نوکنده، باغو در جنوب شرقی، خورشیدکلا، پاسنده سار و غیر از رودخانه های قره سو و گز بقیه مسیل هایی هستند که به علت موقتی بودنشان در رابطه با خلیج، از ارزش اکولوژیک کمتری برخوردارند. آب شیرین وارده به خلیج در کل به میزان 72520000 متر مکعب می باشد که از قره سو و گز در طول زمستان(فصل بارندگی) وارد خلیج می شوند و فقط 12% از کل آب خلیج را تشکیل می دهد بنابراین آب شیرین وارده به خلیج گرگان تاثیری روی سطح آب و مقدار آب خلیج ندارد. در حال حاظر آب خلیج گرگان مطابق سطح آب دریای خزر تغییر می یابد(کیابی و همکاران،1378).

 

1-2-2- خصوصیات فیزیکی و شیمیایی

 

نزولات آسمانی، آب های زیرزمینی و نوسانات دریای خزر از منابع آبی خلیج گرگان به شمار می روند. بستر آن شامل رسوبات رودخانه ای، دریایی و بادی است که مواد آلی موجود در این رسوبات بیشتر شامل بقایای گیاهان و بخش های غیر اسکلتی صدف های دریایی می باشد و درصد بالای کربنات کلسیم را نشان می دهد. شفافیت خلیج از 2/0 متر تا 1/2 متر در نوسان می باشد. بیشترین اکسیژن محلول در ماه های زمستان با 1/11 میلی گرم در لیتر در بهمن ماه و کمترین آن در تابستان 4/2 میلی گرم در لیتر در شهریورماه هست. همچنین کمترین و بیشترین درجه حرارت آب در بهمن ماه 7 درجه سانتیگراد و تیرماه 5/28 درجه سانتی گراد گزارش شده است(کیابی و همکاران،1378).

 

Ph آب خلیج در طول سال 8 تا 5/8 بوده است. سختی آب در فصول گرم سال بیشتر از فصول سرد بوده و کربنات کلسیم بین 4/1170 تا 3/7700 میلی گرم در لیتر در نوسان می باشد غلظت کاتیون های موجود در خلیج از قبیلNa،K، Ca، Mg و آنیونهای Cl، و so4 از شرق به غرب بیشتر می شود به نظر یکی از دلایل آن عمق کم خلیج و تبخیر بیشتر آب و همچنین بسته بودن انتهای خلیج می باشد ولی در ابتدای خلیج به دلیل تبادلات آبی بین دریا و خلیج گرگان میزان یون های موجود با دریا هماهنگی دارد.منابع آلوده کننده خلیج گرگان شامل فاضلاب های شهری، صنعتی، سموم کشاورزی است که میزان این آلودگی ها در فصل تابستان به حداکثر میرسد که در نتیجه کاهش شدید اکسیژن را به دنبال دارد. با توجه به بررسی های بعمل آمده دمای متوسط سالیلنه خلیج گرگان 7-17 درجه سانتی گراد می باشد و چون دمای آب هر سال پائینتر از 5 درجه و بالاتر از 30 درجه سانتی گراد نمی رود، شرایط مناسبی را برای رشد ارگانیسمها فراهم می نماید. آب خلیج گرگان از نظر میانگین پی اچ، قلیائیت تام و سختی کل با آب دریا تفاوت چندانی ندارد.اما EC و بالطبع درجه شوری خلیج از دریا تا حدی بیشتر می باشد(کیابی و همکاران،1378).

 

1-2-3- ماهیان خلیج گرگان

از این­رو شناخت و تشخیص به موقع سالمونلا از اهمیت خاصی برخوردار است. با ذكر تمامی این موارد به نظر می‌رسد تشخیص به موقع و كنترل باكتری از وظایف مهم آزمایشگاه‌های میكروب‌شناسی است. امروزه از 3 روش رایج به تشخیص باكتری می‌پردازند:

 

ـ روش‌های كشت سنتی و آزمایشات بیوشیمیایی.

 

ـ روش‌های سرولوژیكی.

 

ـ روش‌های مولكولی.

 

     برای تشخیص استفاده از روش­های سنتی مبتنی بر محیط كشت قابل قبول است ولی وقت­گیر است و برای تایید جواب نهایی چند روز به­طول می­انجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوه­بر این، روش­های ایمنولوژیك مانند الایزا وIMS نیز برای شناسائی سالمونلا توسه یافته­اند.

 

. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با این­حال اختصایت كم و هزینه­های بالا، استفاده ازین روش­ها را محدود كرده است. اخیرا روش­های مولكولی مانند PCR و real time PCR به­طور گسترده در شناسائی سالمونلا استفاده می­شوند كه روش­هایی كارآمد و حساس هستند.

 

Krascsenicsova et al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).

 

     با این­حال این روش­ها نیازمند سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت­اند. از­این­رو نیاز به یك روش دقیق، حساس، آسان و به­صرفه­تر است. در سال 200 یك گروه ژاپنی یك روش تشخیص مولكولی به نام LAMP را معرفی كردند .(Notomi et al., 2000)از آن زمان روش LAMP به عنوان یك روش اختصاصی، حساس و سریع برای شناسائی پاتوژن­های ناشی از مواد غذائی مورد استفاده است. یك روش ساده، بدون نیاز به سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت و به آسانی قابل اجرا است(Hara-Kudo et al., 2005; Notomi et al., 2000).

 

     هدف این تحقیق شناسائی باكتری سالمونلا تیفی در سالاد سبزیجات و سس مایونز آلوده با استفاده از روش LAMP، به­عنوان روشی سریع، حساس و اختصاصی می­باشد.

 

اهداف تحقیق در نگاه اجمالی

 

 

1. طراحی و بهینه­سازی روش LAMP بر اساس ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی

 

1. تعیین حد حساسیت روش PCR و LAMP به روی ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی

 

1. مقایسه دو روش PCR و LAM

 

 

• مشخصات جنس سالمونلا

 

1-1-2- تاریخچه

 

در سال 1885 یك دامپزشك آمریكائی به نام دانیل المر سالمون برای اولین بار این باكتری را از خوك جدا كرد وآن را باسیلوس كلرا­سوئیس[1] نامید. در سال 1888 جرم دیگری توسط گارتنر از فردی كه در اثر گاستروانتریت ناشی از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آن­را باسیلوس انتریتیدیس نامید كه بعداً سالمونلا انتریتیدیس خوانده شد. در سال 1900 خواص این باكتری توسط فردی به نام لینیر به­طور رسمی تصویب گردید. از آنجا كه این ارگانیسم ها شبیه به باكتری های جدا شده توسط سالمون بودند، به همین جهت به افتخار كاشف اولیه این باكتری سالمونلا[2] نامیدند(Roumagnac et al., 2006).

 

     در فاصله بین سال­های 1925ـ1900 بزرگ­ترین رویداد در كشف سرولوژیكی آنتی‌ژن‌های سوماتیك و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسیله لیگنیرز انجام شد. در سال 1926 تركیبات پادگنی سالمونلا طبقه‌بندی گردید و جدولی به نام جدول كافمن ـ وایت ایجاد شد. در حال حاضر این جدول دارای حدود 2500 سروتیپ است (Bhatia & Nabb , 1980) .

 

     سالمونلا بطور گسترده در طبیعت توزیع شده است مانند آب آلوده، خاك حاوی مدفوع حیوانات و غیره. به طور عمده این باكتری­ها در روده­ی حیوانات ساكن است و مخزن اصلی آلودگی مرغ، تخم مرغ، دام، حیوانات خانگی و خزندگان است(Cidrp, 2009).

 

 2-1-2- خواص شكلی

 

اعضای جنس سالمونلا باكتری­های میله­ای شكل و اندازه­ی آن 5-2 ´5/1-7 /. میكرون بوده است.گرم منفی، بدون اسپور و متعلق به خانواده­ی انتروباكتریاسه­اند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اكثر اعضای این جنس متحرك و با تاژه­ی پری­تریش­اند به­جز چند مورد استثناء مانند سالمونلا گالیناروم[3] و سالمونلا پولوروم[4] (et al., 2005 Hara-Kudo).

 

3-1-2- خواص بیوشیمیایی

 

اعضای این جنس قادر به تخمیر گلوكز بوده ولی از تخمیر ساكارز و لاكتوز نا­توانند. بیشتر انواع سالمونلا ها گلوكز، مالتوز، مانیتول، دولسیتول، دكسترین و سوربیتول را تخمیر می كنند و اسید و گاز بوجود می آورند. اكثر سویه­ها H2sرا از منبع سولفوری معدنی تولید كرده و تولید H2S یکی از واکنش های کلیدی در تشخیص سالمونلاها می­باشد. به استثنای سروتیپ تیفی[5] در بیشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ایجاد می­کنند. در سیترات به عنوان تنها منبع كربن رشد می­كنند اما برخی از گونه ها مانند سالمونلاتیفی و سالمونلا پاراتیفی A سیترات منفی هستند Aksoy, 2004)). این باكتری اكسیداز منفی و كاتالاز مثبت بوده. از تولیدات این باكتری لیزین در كربوكسیلات، سولفات هیدروژن وارنیتین می‌باشد.

 

( Alcamo , 1997 ; Connie & Manuselis, 2000) .

 

   از دیگر ویژگیهای بیوشیمیایی این است كه اكثر سالمونلاها عدم تولید اندول، عدم تولید آنزیم‌های اوره آز،   لیپاز، دزاكسی ریبونوكلئاز، فنیل‌آلانین و تریپتوفان دآمیناز، دكربوكسیلاسیون اسیدهای آمینه لیزین، اورنیتین و آرژنین، واكنش مثبت در آزمایش متیل‌رد(MR) و واكنش منفی در آزمایش وژس ـ پروسكوئر (VP) مثبت می‌باشد.( (Alcamo , 1997 ; Dolye & Beuchat , 2007.

 

 4-1-2- مقاومت در برابر عوامل فیزیكی و شیمیایی

 

این باكتری روی محیط كشت ماهها زنده می­مانند. حرارت 60 درجه را 15 تا 20 دقیقه تحمل می­كنند، سالمونلاها مدت 13 ماه در لاشه­های آلوده نگهداری شده در یخچال، 120 روز درآب، 280 روز در خاك باغچه و مدت بسیار طولانی در شیرخشك­های بدون چربی و موادغذایی دارای تخم مرغ زنده می­مانند. سالمونلاها نسبت به سرما مقاوم بوده و مدت3 ماه در برف و یخ زنده مانده واز این طریق می­توانند اپیدمی به­وجود آورند. كلرامنفیكل استرپتومیسین و بسیاری از آنتی بیوتیك های وسیع الطیف بر آن موثرند پنی سیلین بر آن كاملا بی­اثر است. سالمونلاها همچنین نسبت به املاح صفراوی مقاومند وبه همین دلیل از این مواد نیز علاوه بر رنگ­ها در تهیه محیط‌های غنی‌كننده استفاده می‌كنند Aksoy, 2004)).

 

 5-1-2- خواص كشت

 

اعضای این جنس هوازی بی­هوازی اختیاری می­باشند. مزوفیل بوده و رشد بهینه­ی آن در دمای 37درجه است.با این­حال برخی از سالمونلا­هادر شرایط شدید زیست محیطی مانند درجه حرارت بالای 54 درجه و سرمای 4-2 درجه را تحمل كنند. pH مناسب برای رشد آن 5/7-5/ 6 می باشد ولی pH حدود 9- 5/4  را می تواند تحمل كند و اگر pH پائین­تر از 4 برود باعث از بین رفتن میكرو­ارگانیسم می­شود. pH بیشتر از 9 صرفا از رشد آن جلوگیری می­كند. غلظت نمك 3/ 5 % بالاتر عاملی در جهت جلوگیری از رشد و تكثیر باکتری است (Jay et al., 2005 ; Doyle.M, 2007).

 

     اکثر سالمونلاها در روی آگار مغذی بعد از 24 ساعت پرگنه هایی به قطر 3-2 میلی متر و به رنگ سفید، خاکستری، مرطوب ،کروی، مسطح، برجسته و صاف ایجاد می کنند. اندازه و درجه کدورت پرگنه ها به نوع سروتیپ بستگی دارد. سالمونلاها در محیط های مایع نظیر آبگوشت مغذی و آب پپتونه رشد زیادی دارند Jay et al., 2005)).

 

     انواع محیط‌های غنی كننده می‌توان به آبگوشت تتراتیونات آبگوشت سلنیت F، آبگوشت را پاپورت (حاوی كلریدمنیزیم و سبزمالاشیت) و آبگوشت سلنیت سیستین اشاره كرده معمولاً بعد از 24ـ18 ساعت از محیط‌های غنی كننده روی محیط‌های انتخابی جامد كشت می‌دهند. از محیط‌های انتخابی و تفریقی می‌توان به محیط مك‌كانكی و محیط سالمونلا ـ شیگلا، محیط سبز درخشان، محیط آهن لیزین‌دار، محیط داكسی كلات سیترات یا محیط لیفسون(DCA)، محیط هكتوئن و محیط داكسی كلات ـ لیزین ـ گزیلور اشاره كرد. محیط بیسموت سولفات آگار، نیز به عنوان محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلا مورد استفاده قرار می‌گیرد چرا كه قدرت انتخابگری این محیط بالاست. این باكتری‌ها معمولاً كربوهیدرات را با تولید اسید و گاز تخمیر می‌كنند.

 

. (D’ Aoust , 1991 ; D’ Aoust , 1998 ; Connie & Manuselis, 2000 ; Ferretti , 2001)

 

6-1-2 شرایط رشد سالمونلاها

 

سالمونلاها قادرند در محیط‌های ساده آزمایشگاهی رشد نمایند و از تركیبات ساده كربن‌دار به عنوان منبع كربن و انرژی و از تعداد زیادی از تركیبات ازت به عنوان منبع نیتروژن استفاده كنند (D’Aoust , 1998).

 

اكثر سالمونلاها پروتوتروف بوده و در میحط حداقل نمك با یك منبع كربن مناسب و یا محیط حداقل آمونیوم ـ گلوكز توانایی رشد دارند .(Morse, 1988)اكثر سویه‌های سالمونلاتیفی جهت رشد احتیاج به اسید آمینه تریپتوفان دارند. رشد سالمونلاها در دامنه حرارتی 5 تا 47 درجه است ولی دمای اپتیمم 37 درجه است .(D’ Aoust , 1991)

 

     بعضی از گونه‌های سالمونلا درجه حرارت‌های بالاتر از c ْ54 را نیز تحمل می‌كنند و عده‌ای دیگر خواص سرما دوستی را بوسیله رشد كردن در c ْ4ـ2 از خود نشان دادند. دردرجه حرارت‌های پائین امكان رشد و بقای سالمونلا بیشتر است. گزارش شده كه سالمونلاها نسبت به خشكی حساسند از این­رو انتشار آن­ها از طریق گرد و غبار و ذرات خشك كمتر از آب و مواد غذایی مرطوب است. بقاء سالمونلاها به طور نسبی به درجه حرارت محیط وابسته است .(Davis , 1996) به طوریكه در 55 درجه سانتی‌گراد در عرض یك ساعت و در 60 درجه در مدت 15 دقیقه نابود می‌شوند.

 

     پاستوریزاسیون شیر باعث از بین رفتن سالمونلاها می‌گردد. شیر به مدت 3ـ2 ثانیه در 66 درجه سانتی‌گراد، تخم‌مرغ به مدت 10 دقیقه در 55 درجه سانتی‌گراد و گوشت به مدت 10ـ15 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد معمولاً عاری از سالمونلای زنده خواهند شد .(Alcamo , 1997)

 

   رشد سالمونلا بوسله منابع مختلف كربن و نیتروژن تنظیم می‌شود. اندازه باكتری و میزان متوسط اجسام نوكلئوزیدی هر دو مستقیماً به میزان رشد وابسته‌اند. حساسترین معرف تغییر در میزان رشد، RNA ریبوزومی است. به جز مواردی كه میزان رشد بسیارپائین است، میزان ریبوزوم‌ها درهر میلی‌گرم پروتئین‌ با میزان رشد متناسب است. به دنبال افزایش سنتز RNA به آرامی میزان سنتز پروتئین و DNA نیز افزایش می‌یابد. این مسأله به دلیل نقش تنظیمی RNA در سنتز تركیبات یافته‌ای است. آب نمك با غلظت بیش از 10% اثر كشندگی روی باكتری سالمونلا دارد   .(D’ Aoust , 1991 ; Quinn , 1994)

 

 7-1-2- بقا سالمونلا

 

بقای سالمونلاها در محیط تحت‌تأثیر عوامل مختلفی است. گزارش شده كه سالمونلا دابلین در زمستان حداقل به مدت 73 روز و در تابستان 119 روز در مدفوع زنده می‌ماند. بنا به تحقیقات بقا سالمونلاتیفی موریوم در چراگاه و خاك و بسته حدود 200 روز تخمین زده شده است(.(Connie & Manuselis , 2000

 

بقاء سالمونلاها به طور نسبی به درجه حرارت محیط وابسته است به طوری‌كه سالمونلاتیفی موریوم و سالمونلا كلراسیس در c ْ29 به ترتیب 4 و 9 روز و در c ْ60 به مدت 25 و 38 روز زنده می‌مانند. مقاومت به حرارت در مورد سالمونلایی كه در یك محیط غنی از مواد مغذی رشد می‌كنند و یا در محیطی با aw كم هستند بیشتر از آنهایی است كه در یك محیط فقیرند. بررسی‌ها نشان داده كه اگر سالمونلا تیفی موریوم در معرض محیط اسیدی ملایم (6 – 5/5) قرار گیرد سلول تا pH > 5/4 را تحمل می‌كند Foster , 1995)).

 

 8-1-2- زیستگاه

 

سروتیپ­های جنس سالمونلا از مهم­ترین باكتری­های میله­ای گرم منفی، عامل التهاب ­های روده­ای حاصل از مواد غذائی است كه با منشا انسانى و حیوانى پراكنش وسیعى در طبیعت دارند. زیستگاه اصلی سروتیپ­های سالمونلا، روده جانورانی همانند پرندگان، خزندگان، جانوران مزرعه­ا ی و انسان می­باشد .می­تواند از ماهی و لاك­پشت نیز به­طور مستقیم انتقال یابد. انتشار این باکتری از حیوان به حیوان دیگر و استفاده از مواد غذایی دامی آلوده به سالمونلا توجیه کننده این مطلب است که حیوانات به عنوان مخزن باکتری می­باشند MIRZAIE,2010)).